AI Жвачка для диагностики гриппа

[AI]

Ничто не бывает столь смертоносным как обычный грипп. По сути, любое заболевание может оказаться смертоносным, если оно не было выявлено на раннем этапе и/или не лечилось должным образом. Когда речь заходит о заболеваниях, которые имеют высокую степень инфицируемости, то важным является раннее выявление больных еще до того как начнут проявляться первые симптомы. Классические методы диагностики хоть и действенны, но не всегда доступны ввиду экономических или других факторов. Потому группа ученых из Американского химического общества (Вашингтон, США) разработали доступный и эффективный диагностический инструмент раннего выявления гриппа, который выглядит как обычная жевательная резинка. Из чего состоит жвачка-диагност, как именно она работает, и насколько точна ее диагностика? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования


Грипп вызывает острые респираторные заболевания, ежегодно унося около 500000 жизней. Преобладающие циркулирующие типы A и B можно дополнительно подразделить: тип B подразделяется на линии B/Victoria/2/87 и B/Yamagata/16/88, а тип A (HxNy) подразделяется на подтипы на основе поверхностных ферментов гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N). Хотя в сезоне 2020/2021 гг. число случаев заражения гриппом снизилось из-за мер по борьбе с пандемией COVID-19, риск циркуляции вирусов гриппа не следует недооценивать.

Апокалиптические вспышки гриппа включают «испанку» (1918–1920 годы), когда последующие волны вируса H1N1 поразили более четверти населения Земли, сделав ее одной из самых смертоносных пандемий в истории. Вирус H3N2, вызвавший мировую эпидемию в 1968 году, продолжает циркулировать и сегодня. Грипп может передаваться от животных, как это происходит с птичьим гриппом. В период с 2022 по 2024 год в США сообщалось о зоонозных инфекциях, связанных с молочным скотом, птицей и неизвестными источниками животного происхождения; большинство случаев было идентифицировано как H5N1. Кроме того, в 1997 году птичий грипп впервые напрямую передался человеку от домашней птицы, а вирусы свиного гриппа вызывали у людей отдельные случаи заражения. В 2009 году произошла еще одна пандемия, вызванная H1N1: на этот раз более 80% смертей пришлись на людей младше 65 лет — резкое отличие от типичных сезонных эпидемий гриппа. В ответ на это правительство США разработало «Национальную стратегию реализации мер против пандемии гриппа», включающую создание диагностических систем для определения пациентов, инфицированных вирусом гриппа или страдающих вторичными бактериальными инфекциями.

Если грядущая пандемия гриппа снова разразится, мы должны быть готовы к мгновенному скринингу регионов практически неограниченного размера, будь то города, штаты или целые континенты. Высокоточные методы диагностики, такие как ПЦР, обеспечивают удовлетворительную чувствительность (т.е. правильно идентифицируют инфицированных) и специфичность (т.е. правильно идентифицируют здоровых). Однако они медленные, а их широкое применение логистически сложно или чрезмерно дорого, что препятствует эффективному реагированию на пандемии, особенно в странах с низким уровнем дохода.

Как показала пандемия COVID-19, серологические тесты не всегда точны на ранних, бессимптомных стадиях, при этом максимальная чувствительность достигается в течение первой недели после появления симптомов. Таким образом, в современных подходах к гриппозным инфекциям существует значительный пробел, что делает эти подходы потенциально менее эффективными. Многие доступные методы либо слишком сложны для широкого применения, либо не позволяют точно определить досимптомные стадии, когда грипп может эффективно распространяться. Таким образом, существует острая потребность в легкоизготавливаемых, легко поставляемых и простых средствах защиты первой линии. Эти средства могли бы помочь быстро выявить лиц с риском заражения гриппом, чтобы их можно было поместить в карантин. За этим первым шагом могли бы последовать более точные, хотя и более медленные и более дорогие подтверждающие тесты.

Поэтому ученые решили создать систему тестирования на грипп, которая была бы быстродоступной, дешевой в производстве, простой в распространении и реагирующей на ранних фазах инфекции в качестве предварительного условия для глобального использования. Ради этого было решено отказаться от сложных детекторов и оборудования в пользу детектора, доступного каждому, везде и в любое время: языка. Таким образом, можно химически задействовать критически важный этап в репликации вируса: необходимость нейраминидазы для расщепления α-гликозидных связей. Были синтезированы алкилированные N-ацетилнейраминовые кислоты с последующим гликозидным связиванием модельной молекулы вкуса: монотерпен тимол.

Изображение №1

Сенсорная молекула на основе N-ацетилнейраминовой кислоты была химически модифицирована для специфического реагирования на вирусную, но не бактериальную нейраминидазу в концентрациях, обнаруженных в слюне пациентов с активной формой гриппа. У этих пациентов синтезированные молекулы или сенсоры используют необходимую вирусу нейраминидазу для высвобождения инфекционного агента из клеток-хозяев. В окончательной химической конструкции вирусная, но не бактериальная нейраминидаза отщепляет тимол от молекулы в слюне человека. В будущих разработках эти сенсоры могут быть интегрированы в жевательную резинку или тонкую пленку (схема выше).

Результаты исследования


Были синтезированы и исследованы два сенсора на основе N-ацетилнейраминовой кислоты:

• 
  тимол, связанный O-гликозидной связью с немодифицированной N-ацетилнейраминовой кислотой — обозначенный как «неметилированный эталонный сенсор» (6);
  
  
• 
  тимол, связанный O-гликозидной связью с 4,7-ди-O-метил-N-ацетилнейраминовой кислотой, обозначенный как сенсор (15).
  

В качестве исходного соединения использовалась N-ацетилнейраминовая кислота, из которой по модифицированным протоколам была синтезирована 4,7-ди-O-метил-N-ацетилнейраминовая кислота (10). После ацетилирования гидроксильных групп соединений (11) и (2) аномерная позиция подвергалась хлорированию и последующему гидролизу в водной среде.

Изображение №2

Гликозилирование тимола проводилось с использованием реакции Мицунобу, которая считается более подходящей для ароматических соединений, чем классическая реакция Кенигса–Кнорра. После депротекции соединений (5) и (14) с применением метоксида натрия и гидроксида лития были получены соответственно (не)метилированные сенсоры (6) и (15) (2A). Для проверки эффективности крупномасштабного синтеза соединение (14) подвергалось депротекции без промежуточной очистки, а очищался только конечный продукт — сенсор (15).

Были испытаны три подхода к связыванию тимола с модифицированным скелетом N-ацетилнейраминовой кислоты и последующей депротекции:

1. 
   Первый подход. Для упрощения очистки соединения (14) использовался полимерсвязанный реагент PPh₃, что позволяло удалять побочный продукт Pph₃O простой фильтрацией. Однако после 24 часов при комнатной температуре конверсия реакции при использовании 1–1.3 эквивалента диэтил-азодикарбоксилата (DEAD от diethyl azodicarboxylate) оказалась недостаточной. Увеличение количества DEAD до 3 эквивалентов повысило степень превращения, но привело к образованию побочного продукта, осложнившего очистку и снизившего выход целевого соединения. Кроме того, β-аномер сахара не удавалось изолировать, так как побочный продукт элюировался совместно с ним при хроматографии средней производительности.
   
   
2. 
   Второй подход. Реакция проводилась с 1–1.3 эквивалента DEAD, но с растворенным PPh₃. Это позволило повысить выход и получить чистый β-сенсор (15). Данная стратегия также исключала необходимость очистки промежуточного соединения (14), что делало метод перспективным для эффективного крупномасштабного производства сенсора (15) (2A).
   
   
3. 
   Третий подход. Для исключения стадий с нестабильными промежуточными продуктами (соединение 13-1) была разработана альтернативная схема (2B). В этом случае гидроксильные группы в позициях 8 и 9 соединения (11) защищались, тогда как аномерная гидроксильная группа, необходимая для реакции Мицунобу, оставалась свободной, что позволяло напрямую присоединить тимол. После финальной депротекции был получен сенсор (15).
   

Таким образом, третий подход синтеза оказался наиболее рациональным: он требовал на два этапа меньше, чем второй, и снижал количество операций с лабильными промежуточными соединениями, обеспечивая более надежный и технологичный процесс (2B).

Не было необходимости разделять аномеры на этапе синтеза прекурсора, поскольку разделение целевого сенсора на α-аномеры (время элюирования для α-сенсора (15) — t = 5.07 мин) и β-аномеры (время элюирования для β-сенсора (15) — t = 4.90 мин) методом обратной фазовой колоночной хроматографии прошло успешно. Конформации α- и β-аномеров были подтверждены с помощью спектроскопии ¹H ЯМР, ^{13</supC ЯМР и HMBC ЯМР. Кроме того, для расширения химического диапазона от ароматических вкусовых молекул (тимол) к насыщенным соединениям (ментол) был проведен синтез, в котором ментол конъюгировался с (не)модифицированной N-ацетилнейраминовой кислотой посредством реакции Кенигса–Кнорра.}

α- и β-аномеры сенсора (15) были протестированы на цитотоксичность с использованием клеточных линий HEK 293 (человеческие клетки почек) и NIH 3T3 (клетки фибробластов мыши). Оба аномера не вызывали снижения жизнеспособности клеток при концентрациях до 1.0 мМ (более 90% выживаемости), что свидетельствует об отсутствии цитотоксического эффекта.

Стабильность α-сенсора (15) оценивалась в течение 4 недель при различных условиях хранения и стрессовых испытаний: −20 °C, 4 °C и 25 °C при относительной влажности 60%, а также 50 °C при влажности 75%. Во всех условиях хранения сенсор сохранял не менее 95% стабильности, за исключением стрессового режима при 50 °C, где стабильность составила 94%.

Изображение №3

Синтезированные сенсоры были исследованы на специфичность к рекомбинантной нейраминидазе вируса гриппа A (H1N1) (вирусная нейраминидаза) и рекомбинантной нейраминидазе M. Viridifaciens в различных средах: фосфатно-солевом буфере (PBS), буфере M. viridifaciens (50 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 4.5) и слюне человека. Было установлено, что бактериальная нейраминидаза более эффективно расщепляет гликозидные связи по сравнению с вирусной. Для определения клинически значимой активности нейраминидазы в слюне пациентов с лабораторно подтвержденным (ПЦР-положительным) гриппом была собрана слюна у госпитализированных больных на поздней стадии заболевания, что соответствует примерно 4–7 дню после заражения. Образцы были получены в течение двух эпидемических сезонов — 2017/2018 и 2022/2023 годов (3A). Активность нейраминидазы составила 8.9 ± 6.5 мЕд/мл (n = 16, медиана = 7.8 мЕд/мл) и 13.4 ± 8.3 мЕд/мл (n = 18, медиана = 13.1 мЕд/мл), причем различия между сезонами 2017/2018 и 2022/2023 статистически значимыми не были. Поскольку все образцы были получены у госпитализированных пациентов в разное время, разброс значений относительно медианы отражает естественные колебания активности нейраминидазы в течение болезни. Как отмечалось ранее, наиболее высокие концентрации нейраминидазы наблюдаются на ранней стадии заболевания, что совпадает с предполагаемым применением сенсора как раннего индикатора инфицирования.

С учетом активности нейраминидазы, измеренной в слюне пациентов с гриппом, для анализа работы сенсора использовались диапазоны активности 5–10 мЕд/мл. В качестве отправной точки был протестирован коммерчески доступный сенсор нейраминидазы 4-MUNANA (4-метилумбеллиферил-N-ацетил-α-D-нейраминовая кислота), который является неспецифическим субстратом как вирусной, так и бактериальной нейраминидазы. Неспецифичность 4-MUNANA объясняется отсутствием метильных групп в позициях O4 и O7 в его скелете нейраминовой кислоты — аналогично тому, что наблюдается у неметилированного эталонного сенсора (6). При различных концентрациях вируса H1N1 (A/California/7/2009) — 10⁴ и 10⁵ ffu/мл (ffu от foci forming units, т. е. единицы, образующие очаги заражения) — сенсор 4-MUNANA (в концентрации 4 мМ, время инкубации 10–30 мин) эффективно расщеплялся, образуя продукт 4-метилумбеллиферон (4MU) в концентрациях 0.04–0.056 мМ при 10⁴ ffu/мл и 0.20–0.44 мМ при 10⁵ ffu/мл (3B).

Чтобы сопоставить эти результаты с активностью нейраминидазы, 4-MUNANA (4 мМ) был протестирован с вирусной нейраминидазой известной активности. Это соответствовало приблизительно 4.1 ± 1.0 мЕд/мл при 10⁴ ffu/мл и 55.5 ± 9.0 мЕд/мл при 10⁵ ffu/мл. Таким образом, полученные значения активности оказались сопоставимы с уровнями нейраминидазы, измеренными в слюне пациентов, что подтверждает клиническую значимость диапазона активностей, в котором проводились эксперименты (3A).

Была проведена оценка селективности и чувствительности неметилированного сенсора (6) по отношению к вирусной и бактериальной нейраминидазе (3C). При инкубации сенсора (6) с вирусной или бактериальной нейраминидазой наблюдалось повышение концентрации тимола в течение 1.5 часов, тогда как для β-неметилированного контрольного сенсора (6) с вирусной нейраминидазой увеличение концентрации тимола зафиксировано не было (3C). Эти результаты указывают на предпочтительное расщепление нейраминидазой α-гликозидных связей. Следовательно, только сенсоры, в которых молекула вкусового соединения присоединена α-гликозидно, подходят для детекции вируса гриппа. Кроме того, неметилированный сенсор (6) не проявляет избирательности между вирусной и бактериальной нейраминидазой, что делает его непригодным для использования в диагностике гриппа.

На основе полученных данных был разработан сенсор (15) (3D). α-Аномер сенсора (15) проявил устойчивость к действию бактериальной нейраминидазы, но реагировал на вирусную нейраминидазу в течение 30 минут (3D). Как показано ранее на примере неметилированного контрольного сенсора (6), конформация присоединенного вкусового фрагмента играет ключевую роль в процессе его высвобождения. Таким образом, вкусовое соединение обнаруживалось только у α-гликозидно связанного сенсора (15) при воздействии вирусной нейраминидазы. Эти результаты подтвердили, что модификация N-ацетилнейраминовой кислоты имеет решающее значение для различения вирусной и бактериальной нейраминидазы. В частности, замещение в положении O4 необходимо для ингибирования бактериальной нейраминидазы, тогда как замещение в положении O7 снижает активность других вирусных нейраминидаз (например, вируса паротита и парагриппа). В отличие от сенсоров, применяемых в тестовых системах и требующих добавления дополнительного реагента для колориметрического или хемилюминесцентного отклика, разработанные сенсоры обеспечивают высвобождение вкусовой молекулы непосредственно после ферментативного расщепления вирусной нейраминидазой.

α-Сенсоры (15) и (6) сохраняли стабильность в фосфатно-солевом буфере (PBS) и буфере M. viridifaciens на протяжении как минимум 1.5 часа, и все эксперименты проводились в пределах этого временного интервала.

Скорость расщепления α-сенсора (15) зависела от его концентрации: например, при концентрации 40.0 мМ она была выше примерно в 710 раз по сравнению с 0.25 мМ. Также был проведен тест на ингибирование с использованием противовирусного ингибитора нейраминидазы — фосфата осельтамивира. При концентрациях не менее 0.04 мМ в PBS осельтамивир подавлял расщепление 1.0 мМ α-сенсора (15), что указывает на конкурентное связывание осельтамивира и α-сенсора (15) в активном центре фермента.

Далее испытания были перенесены из буферных сред в человеческую слюну (3E). Инкубация α-неметилированного референс-сенсора (6) в слюне приводила к высвобождению тимола в течение 30 минут. Напротив, для α-сенсора (15) не наблюдалось высвобождения ни в нативной человеческой слюне, ни в слюне, содержащей бактериальную нейраминидазу. Однако при инкубации α-сенсора (15) в слюне, в которую была добавлена вирусная нейраминидаза, тимол обнаруживался уже через 30 минут. Этот результат подтверждает предыдущие данные о том, что α-неметилированный сенсор (6) неспецифически расщепляется различными нейраминидазами, тогда как модифицированный α-сенсор (15) избирательно реагирует только на нейраминидазу вируса гриппа.

Подобно реакции, наблюдавшейся для 4-MUNANA (3B), α-сенсор (15) расщеплялся живыми вирусами (3F), что приводило к высвобождению 0.013–0.028 мМ тимола при концентрации 10⁴ ffu/мл и 0.11–0.27 мМ тимола при 10⁵ ffu/мл. Эти условия соответствовали клинически релевантным концентрациям вирусной нейраминидазы (3A). Будущие клинические испытания должны подтвердить полученные результаты на основе данных, сообщаемых пациентами о вкусовых ощущениях, и определить различия в работе сенсора на до- и постсимптоматических стадиях. Однако представленные здесь данные, в сочетании с ранее опубликованными, свидетельствуют о том, что данный сенсор может эффективно функционировать на всех этапах заболевания. Сообщается, что титры вируса H1N1 снижаются как минимум на 1 log₁₀ единицу в день после пикового уровня, наблюдаемого на второй день после инфицирования. Это указывает на то, что условия расщепления для α-сенсора (15) особенно благоприятны на ранних стадиях заболевания по сравнению с поздними. Использование образцов слюны от пациентов поздней стадии, как в данном исследовании, представляет собой консервативный сценарий оценки эффективности сенсора.

Было рассчитано количество α-сенсора (15), необходимое для перорального применения: учитывая, что тимол ощущается на вкус при концентрациях 1100–1700 ppb, а активность нейраминидазы в слюне пациентов на поздней стадии составляет 4.1 ± 1.0 мЕд/мл (3A), предсказывается, что на одно использование потребуется 2.1–11.5 мг сенсора. В будущем конструкция сенсора может быть усовершенствована для снижения требуемого количества сенсора или сокращения времени до восприятия вкуса. Например, замена тимола на денатоний позволит использовать наиболее горькое вещество, применяемое в пищевых добавках, с порогом восприятия вкуса в 10–100 раз ниже, чем у тимола. Также возможен вариант с заменой острого тимола на горький денатоний или на сенсор, высвобождающий краситель при расщеплении для визуальной детекции, что может помочь преодолеть проблемы, связанные с потерей вкуса у пациента во время заболевания.

Изображение №4

Селективность, продемонстрированная α-сенсором (15), была дополнительно изучена с использованием данных кристаллографии (4A). В структуре M. viridifaciens по рентгеновским данным (PDB: 1EUS) гидроксильная группа O4 субстрата взаимодействует с D131 (аналогично другим бактериальным и млекопитающим нейраминидазам). В отличие от этого, в аналоге вируса H1N1 (PDB: 3TI6) наблюдается более крупный карман, который можно модифицировать через замещение. В обоих случаях карбоксильная группа комплексируется с триадой аргининов, что обеспечивает взаимодействие с ключевым каталитическим тирозином (Y370/406) и формирование оксокарбониевых промежуточных соединений. Точечные мутации этого остатка могут существенно влиять на активность фермента. N-ацетилнейраминовая кислота формирует аналогичные взаимодействия с ингибиторами, наблюдаемыми в этих кристаллических структурах, через искажение своей пиранозной кольцевой формы. Такой способ связывания позволяет присоединяться только α-гликозидным субстратам, при этом соседние мономеры (или, в данном случае, тимол) располагаются наружу и не участвуют в прямых взаимодействиях.

Было выполнено молекулярное докирование (не)метилированных сенсоров, связанных с тимолом или ментолом, отражающее вкусовые молекулы, использованные при синтезе. Метилированный α-сенсор (15) и α-неметилированный сенсор (6) подходили в активный центр вирусной нейраминидазы, тогда как только сенсор (6), а не (15), соответствовал активному центру бактериальной нейраминидазы. Соответственно, оценки аффинности для метилированных сенсоров в бактериальной нейраминидазе были неблагоприятными (4B). Эти данные подтверждают наблюдаемую селективность и демонстрируют возможность замены тимола на другие вкусовые элементы, такие как ментол, бензоат денатония или краситель.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы у нему.

Эпилог


В рассмотренном нами сегодня труде ученые рассказали о разработке сенсора, способного специфически обнаруживать вирусную нейраминидазу в слюне человека. Данный сенсор может быть внедрен в жевательную резинку и будет выделять определенный вкус или краситель, если была зафиксирована инфекция. Для этого был синтезирован сенсор, в основе которого лежит N-ацетилнейраминовая кислота, модифицированная с учетом специфики взаимодействия с вирусной нейраминидазой. В отличие от традиционных методов, основанных на химических реакциях с дополнительными реагентами, данный сенсор выделяет вкусовое вещество непосредственно после расщепления вирусной нейраминидазой, позволяя проводить диагностику без использования сложного оборудования.

В ходе экспериментов было установлено, что α-сенсор (15) стабилен в различных буферных растворах и в человеческой слюне, не подвергается расщеплению бактериальной нейраминидазой и выделяет вкусовое вещество только при воздействии вирусной нейраминидазы. Это подтверждает высокую специфичность сенсора к вирусной нейраминидазе. Кроме того, было показано, что активность нейраминидазы в слюне инфицированных пациентов достаточна для активации сенсора, что свидетельствует о его потенциале для использования в клинической практике.

Применение такого сенсора может значительно упростить и ускорить диагностику гриппа, особенно на ранних стадиях заболевания, когда традиционные методы могут быть менее эффективными. Сенсор может быть использован в домашних условиях или в условиях ограниченного доступа к медицинскому оборудованию, что особенно актуально в условиях пандемий или в удаленных регионах.

Немного рекламы


Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?